【摘要】目的:聯(lián)合應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)(LSCM)檢測腦脊液中腦膜癌細(xì)胞CEA的表達(dá)部位并定量測定其熒光含量，探討該技術(shù)在腦膜癌病診斷中的價(jià)值。 方法:應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法以CEA標(biāo)記腦膜癌細(xì)胞及對照組腦脊液細(xì)胞，采用LSCM技術(shù)獲得腦膜癌細(xì)胞掃描圖像并定量測定CEA熒光強(qiáng)度值。結(jié)果:腦脊液中腦膜癌細(xì)胞的CEA表達(dá)為陽性，且部位在細(xì)胞漿中;CEA平均熒光值(36.80±17.17)，與對照組(4.87±1.86)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和LSCM檢測腦脊液細(xì)胞中CEA的表達(dá)可為腦膜癌病的診斷提供可靠依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】腦膜癌病;腦脊液;CEA;激光掃描共聚焦顯微鏡;免疫熒光

本研究聯(lián)合應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微技術(shù)對20例腦膜癌病(meningealcarcinomatosis,MC)患者的腦脊液細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光平均值(CEA)檢測，以探討該方法在MC診斷中的價(jià)值。

1、材料與方法

1.1 標(biāo)本來源：20例MC患者為2007年8月至2008年8月本院、南京腦科醫(yī)院門診及住院收治。男9例，女11例，平均年齡51歲。按腫瘤來源：肺腺癌10例、乳腺癌2例、絨毛膜癌1例、子宮內(nèi)膜癌1例、惡性髓母細(xì)胞瘤2例、未找到原發(fā)病灶4例。16例轉(zhuǎn)移癌病例均由組織病理證實(shí)。對照組20例均為同期本院神經(jīng)內(nèi)科住院收治，經(jīng)腦脊液細(xì)胞學(xué)診斷為病毒性腦膜炎且隨訪已治愈。男8例，女12例，平均年齡41歲。

1.2 試劑與儀器：兔抗人CEA、FITC-羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)公司;Cytospin-3型細(xì)胞玻片離心儀，英國Shandon公司生產(chǎn);TCS-SP5型激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn)，第三軍醫(yī)大學(xué)提供使用。

1.3 方法

1.3.1 CEA標(biāo)記：設(shè)肺腺癌胸水陽性對照組、PBS自發(fā)熒光對照組、PBS+二抗熒光標(biāo)記物對照組。標(biāo)本玻片以10%羊血清封閉30min，滴加1∶100兔抗人CEA，置濕盒內(nèi)37℃孵育1h,4℃過夜，再加入1∶20FITC-羊抗兔IgG,避光置濕盒內(nèi)37℃孵育1h，滴加1∶1000DAPI室溫10min，甘油封片，以上每步驟間均以0.01MPBS漂洗3遍。

1.3.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：分別用488nm和405nm波長的激光器激發(fā)綠色和藍(lán)色熒光。CEA相對熒光含量檢測結(jié)果以平均熒光值和熒光強(qiáng)度地形立體分布圖表示。實(shí)驗(yàn)組及對照組各隨機(jī)選取200個(gè)高倍鏡視野的細(xì)胞，測定每個(gè)細(xì)胞內(nèi)CEA含量的相對熒光值及細(xì)胞面積、周長。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 LSCM掃描熒光圖像及CEA的表達(dá)部位：腦膜癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見分布均勻的綠色熒光，CEA表達(dá)于胞漿;其余淋巴、單核細(xì)胞等僅見DAPI染色的藍(lán)色細(xì)胞核，胞漿未著色。對照組腦脊液細(xì)胞僅見藍(lán)色的細(xì)胞核，胞膜、胞漿及胞核內(nèi)未見綠色熒光，提示無CEA表達(dá)

2.2 CEA熒光強(qiáng)度地形立體分布圖：腦膜癌細(xì)胞圖像為不規(guī)則的蛋糕形，中心凹陷呈火山口狀，底部可見藍(lán)色細(xì)胞核區(qū)域;胞漿區(qū)域呈環(huán)形，頂端不平坦，黃、紅色山峰呈鋸齒樣突起，相對熒光含量由低到高(0→255)藍(lán)→綠→黃→紅。對照組腦脊液細(xì)胞地形平坦，僅見藍(lán)色腎形細(xì)胞核區(qū)域，胞漿基本無熒光分布，單核細(xì)胞。

2.3 腦膜癌細(xì)胞與對照組腦脊液細(xì)胞CEA熒光相對含量及形態(tài)學(xué)參數(shù)比較：腦膜癌細(xì)胞與對照組腦脊液細(xì)胞CEA熒光含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，腦膜癌細(xì)胞的面積、周長與對照組腦脊液細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

兩組腦脊液細(xì)胞EMA/CEA熒光相對含量及形態(tài)學(xué)參數(shù)的比較

3、討論

MC是由于惡性腫瘤在蛛網(wǎng)膜下腔和軟膜內(nèi)彌漫性轉(zhuǎn)移而引起的一系列臨床綜合征，在癌癥患者中發(fā)生率為5%-8%，目前有上升趨勢[1]。肺癌、乳腺癌、胃腸道癌是腦膜癌最常見的原發(fā)灶，腺癌是其主要組織類型[2]。腦膜癌病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，在腦脊液中找到腦膜癌細(xì)胞是診斷本病的最終標(biāo)準(zhǔn)[3]。據(jù)報(bào)道[4]MC患者首次腰穿發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的陽性率僅為45%-60%。

劉振華等[5]報(bào)道常規(guī)CSF細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的陽性率為41.86%，應(yīng)用CEA免疫細(xì)胞化學(xué)法可將陽性率提高到83.72%。Liu等[6]報(bào)道CEA等上皮來源的標(biāo)記物在腦膜癌組的陽性例數(shù)為80%，在良惡性腦膜瘤組為0%，提示多抗體免疫組化檢測可鑒別腫瘤細(xì)胞的組織來源。本實(shí)驗(yàn)MC組CEA陽性率為90%(18/20);常規(guī)MGG染色陽性率60%(12/20)，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示免疫細(xì)胞化學(xué)染色可顯著提高腦膜癌病的診斷率，與國內(nèi)外研究一致。Martínez等[7]應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和LSCM技術(shù)對腦膜血管外皮細(xì)胞瘤中的抑癌基因進(jìn)行了研究。岳劍寧等[8]用LSCM對腦脊液淋巴白血病細(xì)胞線粒體進(jìn)行了立體、定量研究。LSCM觀察可見細(xì)胞核與DAPI結(jié)合呈明亮的藍(lán)色熒光，未見綠色熒光，提示胞核內(nèi)無CEA表達(dá);胞漿內(nèi)可見分布均勻的明亮的綠色熒光，提示CEA表達(dá)于胞漿，與國內(nèi)外報(bào)道一致[9]。從熒光強(qiáng)度地形立體分布圖可見腦膜癌細(xì)胞胞核CEA含量極少，而胞漿內(nèi)CEA含量較高，亦與上述分布相符。對照組細(xì)胞面積和周長相對較小，胞漿內(nèi)CEA含量極低;而腦膜癌細(xì)胞面積和周長相對較大，胞漿內(nèi)CEA含量較高，兩組之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)MC組中2例髓母細(xì)胞瘤檢測CEA陰性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Sulim S,Hoyer M.Meningeal carcinomatosis [J].Ugeskrift for Laeger,2005,167(37):3481-3484.

[2]Toshihiro Suzuki,Hirofumi Sakaguchi,Satoshi Yamamoto,et al.Sudden hearing loss due to meningeal carcinomatosis fromrectal carcinoma [J].Auris Nasus Larynxr,2006,33:315-319.

[3]N.Pavlidis.The diagnostic and therapeutic management of leptomeningeal carcinomatosis [J].Ann Oncol,2004,15 (Supplement 4):285-291.

[4]邱雯靜,楊歡,楊樂,等.腦膜癌病的臨床特點(diǎn)及腦脊液檢查對其診斷的重要意義[J].卒中與神經(jīng)疾病,2007,14(4):217-219.

[5]劉振華,陳建平,宋振海,等.腦脊液EMA和CEA免疫細(xì)胞化學(xué)檢查對腦膜癌病的診斷價(jià)值 [J].山東醫(yī)藥,2007,47(27):101-102.

[6]Liu YL,Sturgis CD,Bunker M,et al.Expression of cytokeratin by malignant meningiomas:diagnostic pitfall of cytokeratin to separate malignant meningiomas from metastatic carcinoma [J].Modern Pathol,2004,17:1129-1133.

[7]Martinez JC,Palomino JC,Samaniego R,et al.Retinoblastoma (Rb) tumor-suppressor pathway alterations in meningeal hemangiopericytomas:High E2F transcription factor 1 expression and loss of Rb expression:study by double immunofluorescence staining and laser-scanning confocal microscopy [J].Cancer,2008,113(1):166-174.

[8]岳劍寧,孔繁元,吳若芬,等.應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡對腦脊液淋巴白血病細(xì)胞線粒體的研究[J]. 北京醫(yī)學(xué),2005,27(4):211-213.

[9]Susanne J,Monica EK,Britta W,et al.Intracellular Targeting of CEA Results in Th1-Type Antibody Responses Following Intradermal Genetic Vaccination by a Needle-Free Jet Injection Device [J].The Scientific World,2007,7:987-999.

[10]鄭繼培,何澤生,余英豪.小腦蚓部髓母細(xì)胞瘤椎管內(nèi)轉(zhuǎn)移1例[J].中國誤診學(xué)雜志,2006,6(7):1414.