【摘要】目的：建立細菌及其產生的內毒素誘導大鼠分泌性中耳炎模型，并探討中耳黏膜中分泌型黏蛋白的表達，及其對中耳積液產生和發展造成的影響。方法：20只SD健康大鼠隨機分為對照組(10只)和實驗組(10只);實驗組建立滅活的流感嗜血桿菌引起的分泌性中耳炎模型，在不同時間段以鱟實驗法檢測中耳積液中的內毒素，ELISA法檢測中耳積液中的黏蛋白。對取材黏膜常規染色和APPAS染色，觀察黏液腺、杯狀細胞。結果：實驗組中鼓室上皮黏膜內毒素含量平均值是對照組鼓室上皮黏膜中含量的2.1倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。ELISA法檢測中耳積液中的黏蛋白，實驗組鼓室上皮黏膜中平均值是對照組中平均值的4.2倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。結論：細菌的分解產物—內毒素，導致中耳黏膜的炎癥反應及中耳腔滲出，引起杯狀細胞分泌黏蛋白，從而導致產生中耳積液，甚至膠耳。

【關鍵詞】黏蛋白;分泌性中耳炎;內毒素

分泌性中耳炎(OME)是指中耳腔存在積液而不伴有急性感染癥狀或體征的一類疾病。本病好發于兒童，特別是那些頑固性或持續性OME，患兒因聽力障礙可能導致言語發育遲緩、學習障礙及心理、行為異常，因而引起廣泛重視^①。由于OME的發病機制至今尚未完全闡明，因此其治療效果尚難以令人滿意。

目前認為，引起OME的病因是多因素的，包括咽鼓管功能障礙、感染和變態反應等，但目前對其病因及發病機制尚未完全清楚。而黏膜高分泌引起的中耳腔出現不易清除的黏液是其主要特征。本實驗旨在探討分泌性中耳炎的始動因素，從引起中耳炎最常見的致病菌著手，研究細菌及其產生的內毒素如何影響中耳黏膜黏蛋白的分泌;揭示內毒素和黏蛋白在分泌性中耳炎積液的發生、發展過程中所起的作用，以便深入認識分泌性中耳炎的發病機制，為臨床早期診治提供理論和實驗依據，并為分泌性中耳炎的預防和兒童聽力保護做出有益探索，為其臨床治療提供新思路。

1、資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康SD大鼠20只，雌雄不拘，體重200～250mg，電耳鏡檢查除外中耳疾患。隨機分為兩組，實驗組選擇分泌性中耳炎最常見的病原菌——滅活的流感嗜血桿菌，以1%戊巴比妥(30mg/kg)經腹腔注射麻醉后，經鼓膜前下方注入細菌懸浮液0.1mL，注射前在瓊脂培養基上培養，保證沒有活的菌株生長，以防引起急性感染;對照組注入等量生理鹽水。

1.2 研究方法

術后1，3，7，14，18d用1%苯巴比妥鈉將大鼠全麻，在手術顯微鏡下觀察鼓膜形態、顏色和色澤，之后隨機處死兩組中2只大鼠，取雙側聽泡，用10%甲醛固定后脫鞘，石蠟包埋切片，常規HE染色光鏡下觀察，取小塊黏膜組織送電鏡檢查。黏膜常規染色和APPAS染色，觀察黏液腺、杯狀細胞。在不同時間段以鱟實驗法檢測中耳積液中的內毒素，ELISA法檢測中耳積液中的黏蛋白。

1.3 統計學方法

以計算機輔助三維測量法分析組織學結果。所有統計資料由SPSS13.0軟件進行統計分析，檢驗水準α=0.05。

2、結果

觀察鼓膜情況：正常大鼠的鼓膜透亮，鼓室無積液，錘骨柄和光錐清晰可辨;造模后大鼠的鼓膜混濁，鼓室積液，光錐消失。

術后1d，APPAS染色正常組和對照組中耳黏膜鼓岬處由立方或扁平上皮和薄層結締組織(固有層)組成，黏膜下層有少數纖維母細胞和少許膠原纖維以及中性多核白細胞、淋巴細胞，光鏡下所有模型組咽鼓管上皮層次增多，黏液腺體擴張、數目增多，小血管明顯充血并有中性粒細胞浸潤和大量增多的分泌細胞。術后1周模型組鼓室黏膜上皮細胞和杯狀細胞明顯增生，炎性細胞浸潤明顯，電鏡下可見大量杯狀(分泌)細胞集結，表面有微絨毛，細胞內有大量成熟的亮顆粒和少許暗顆粒，部分排放到黏膜表面，呈游離的團狀，上皮細胞的內質網擴張，線粒體變形，核固縮或整個細胞結構不清，黏膜下毛細血管擴張充血，明顯增生。術后2周組和4周組出現成纖維細胞增生，有許多纖維母細胞和膠原纖維，新生血管增多，單核巨噬細胞浸潤，中耳黏膜明顯增厚，在細胞間和黏膜下層有許多黏液細胞和黏液滴。

術后1，3，7，14，18d以鱟實驗法檢測中耳積液中的內毒素，結果顯示實驗組中內毒素含量隨時間的增加而增加，平均值為(218.0±191.9)μg/106，是對照組鼓室上皮黏膜(101.57±653.4)μg/106的2.1倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。ELISA法檢測中耳積液中的黏蛋白，實驗組鼓室上皮黏膜中平均值為(4918.0±1931.9)μg/106，是對照組鼓室上皮黏膜中平均值(1001.45±263.8)μg/106的4.2倍，其平均值差異有顯著性(P<0.05)。

3、討論

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科常見病之一，是小兒聽力障礙的主要原因，嚴重影響患兒的語言發育和智力發育。尤其是慢性分泌性中耳炎，病程長，遷延不愈，如不及時治療則易導致鼓膜萎縮、鼓室硬化、慢性中耳炎、膽脂瘤、膽固醇肉芽腫等。其發病與中耳黏膜腺體和杯狀細胞的增生有關，黏膜高分泌引起的中耳腔出現不易清除的黏液是其主要特征^②。黏蛋白是黏液的主要成分，是一種高度糖基化的大分子蛋白質，目前研究認為其高表達與中耳炎發病關系密切。

到目前為止，人體中至少有9種不同的黏蛋白已被確認，按其發現順序命名為MUC1～4，MUC5AC，MUC5B，MUC6～8^③⑧。MUC1，MUC3和MUC4屬于膜結合型黏蛋白;MUC2，MUC5AC，MUC5B和MUC6屬于分泌型黏蛋白;MUC8尚未確定?，F已證明MUC2，MUC5AC，MUC5B和MUC6黏蛋白的基因定位于染色體11P15.5，人們認為它們來源于同一原始基因，因此它們具有結構和基因序列的相似性。MCUI定位于染色體1q21～24，MUC3定位于染色體7q22，MUC4定位于3q29，MUC7定位于4q13～21，MUC8定位于12q24.3^⑨。由于黏蛋白基因的激活和滅活具有器官特異性和上皮細胞特異性，因此某種特定的上皮細胞其黏蛋白基因表達模式不同。

從總體看，黏蛋白可被分成兩組：一組為分泌型黏蛋白(MUC2，MUC5B，MUC5AC，MUC6)，它以膠體形式存在于黏膜表面，其基因編碼簇位于11P15染色體上。另一組為膜結合型黏蛋白，存在于上皮細胞的表層，MUC1，MUC3，MUC4均以跨膜形式存在。黏蛋白是由杯狀細胞分泌的，分布在上皮的表面，與細胞黏附、細胞保護、管腔表面潤滑、入侵微生物的捕獲以及腫瘤生物學等有關。黏蛋白多肽骨架的氨基酸序列有以下特點：高度串聯重復氨基酸序列組成的結構域占極高比例;重復單位富含具羥基側鏈的絲氨酸和蘇氨酸;重復單位的兩側(N和C端)富含半胱氨酸。成熟的黏蛋白羥基側鏈糖基化后形成O連接寡糖的糖蛋白;黏蛋白亞單位之間還可以通過半胱氨酸殘基的巰基(HS)側鏈相互作用形成二硫鍵，構成黏蛋白聚合體，使得黏液具有膠狀特點^⑩。其中MUC1，MUC4和MUC5AC的表達始終局限于表面上皮細胞，前兩者(為膜結合型黏蛋白)表達于杯狀和纖毛細胞，MUC5AC只在杯狀細胞表達。

內毒素是細菌死亡時釋放出的一種具有生物活性的物質。它的主要成分為脂多糖，能引起中耳黏膜結締組織增生，細胞密度增大，毛細血管通透性增高，腺體及杯狀細胞分泌增加，破壞正常黏膜運轉系統，促進中耳積液的蓄積，導致分泌性中耳炎遷延不愈。Yanagihara等^⑾報道，向大鼠氣管內滴入綠膿假單胞菌內毒素，引起大量的中性粒細胞募集和廣泛的氣道上皮細胞表型的改變，即有大量的黏液細胞的增生與化生，MUC5ACmRNA表達和蛋白分泌均增高。此外內毒素也可經過經典途徑及替補途徑激活補體，使嗜堿性粒細胞或肥大細胞釋放組織胺、5羥色胺、激肽和其他血管活性介質作用于靶細胞，從而引起血管擴張，毛細血管通透性增加，同時趨化因子能吸引白細胞向炎癥病灶部位聚集，促進吞噬。在發揮吞噬作用的過程中，釋放溶酶體酶等生物活性物質，除破壞抗原性異物外，同時也可損傷鄰近組織和加劇炎癥，參與分泌性中耳炎的發病。本研究表明：細菌感染引起的分泌性中耳炎中，鼓室黏膜內毒素的含量及杯狀細胞明顯增多，黏蛋白的分泌也明顯增加。這與上述文獻相符，說明內毒素可能是導致分泌性中耳炎出現黏性滲液的始動因素;在急性中耳炎發展為慢性分泌性中耳炎過程中，中耳積液與內毒素和黏蛋白含量存在某種關聯。由此推斷，針對某一特定時期使用降解內毒素的藥物，可以提高機體對內毒素耐受力的糖皮質激素類藥物，有助于減輕內毒素對中耳黏膜的損害，并消除中耳滲液?？沽鞲惺妊獥U菌抗體對流感嗜血桿菌引起的中耳炎可能具有保護作用。

【參考文獻】

[1]Orlin M N,Effgen S K,Handler S D.Effect of otitis media with effusion on gross motor ability in preschool aged children:preliminary findings[J].Pediatrics,1997,99(3):334 337.

[2]Nell M J,Grote J J.Structural changes in the rat middle ear mucosa due to endotoxin and eustachian tube obstruction[J].Ear Arch Otorhinolaryngol,1999,256(4):167 172.

[3]Gum J R,Byrd J C,Hicks J W,et al.Molecular cloning of human intestinal mucin cDNAs,sequence analysis and evidence for genetic polymorphism[J].Biol Chem,1989,264:6 480 6 487.

[4]Gum J R,Hicks J W,Swallow D M,et al.Molecular cloning of cDNAs derived from a novel human intestinal mucin gene[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,171(1):407 415.

[5]Bobek L A,Tsai H,Biesbrock A R,et al.Molecular cloning,sequence and specificity of expression of the gene encoding the low molecular weight human salivary mucin(MUC7)[J].Biol Chem,1993,268(27):20 563 20 569.

[6]Ho S B,Roberton A M,Shekels L L,et al.Expres sion cloning of gastric mucin complementary DNA and localization of mucin gene expression[J].Gastroenterology,1995,109(3):735 747.

[7]Keates A C,Neues D P,Afdhal N H,et al.Molecular cloning of a major human gall bladder mucin:complete c terminal sequence and genomic organization of MUC5[J].Biochem,1997,324:295 303.

[8]Shankar V,Pichan P,Eddy R L,et al.Chromosomal localization of a human mucin gene(MUC8) and cloning CDNA corresponding to the carboxy terminus[J].Am J Pespir Cell Mol Biol,1997,16(3):232 241.

[9]Nollet S,Moniaux N,Maury J,et al.Human mucin gene MUC4:organization of its 5′ region and polymorphism of its central tandem repeat array[J].Biochem,1998,332(3):739 748.

[10]Moniaux N,Escande F,Porchet N,et al.Structural organization and classification of the human mucin genes[J].Front Biosci,2001,6:1 192 1 206.

[11]Yanagihara K,Seki M,Cheng P W.Lipopolysaccharide induces mucus cell metaplasia in mouse lung[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2001,24(1):66 73.